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　　今天推送的文章是2021年1月31日发表在International Journal of Biological Macromolecules上的“Improving the thermostability of trehalose synthase from Thermomonospora curvataby covalent cyclization using peptide tags and investigation of the underlying molecular mechanism”，通讯作者是南京工业大学的江凌教授和朱丽英副教授。

　　海藻糖是一种非还原性双糖，由两个葡萄糖分子通过α,α-1,1-糖苷键连接而成。海藻糖的化学性质有助于在各种应激条件下保护生物大分子，因此被称为“生命之糖”。由于其在食品、化妆品、农业、医药和其他领域的高应用价值，通过生物方法生产海藻糖已引起越来越多的。目前，有三种主要的酶法生产海藻糖，其中海藻糖合成酶（TreS，EC 5.4.99.16）提供了生产海藻糖的最简单途径。实施这一过程的关键是应用具有高转化率和适应性的TreS突变体。然而，目前商用的TreS突变体可能不适合海藻糖的工业生产，因为它们在高温下稳定性差。

　　耐热酶在提高工业规模生物技术工艺的成本效益方面发挥着重要作用。寻找具有高耐热性的酶的最常见策略是从耐热生物中挖掘基因，然而，耐热酶的筛选通常效率低下。随着蛋白质工程的发展，酶的定向进化和理性设计在开发工业应用耐热酶方面取得了重大成功。然而，这些策略仍然需要耗时的优化，有时结果可能是微不足道的，这限制了它们的广泛应用。因此，非常需要开发一种更有效和简化的方法来改善酶的热稳定性。

　　先前已经证明，通过SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher等系统进行蛋白质环化是一种非常有效的策略，可以产生耐热酶。这些Tag/Catcher系统通过两个短的多肽标签导致蛋白质主链的特异性共价结合。目前已有多种酶与SpyTag/SpyCatcher环化，由此产生的环化突变体更耐热，如荧光素酶、木聚糖酶、β-内酰胺酶、植酸酶等，这表明该技术在生物催化中具有巨大应用潜力，但是使用不同肽标签环化的酶的稳定性增强机制和应用尚未详细研究。

　　本研究中所选的T.curvata TreS代表了一种新型高效催化剂，在底物麦芽糖浓度高达30 g/L的情况下，其转化率约为80%。然而，整个生物催化过程在30度下进行，在60度下热处理30分钟后，其一半活性丧失。在先前的研究中，位于活性位点附近的突变被证明是有效的。将T.curvata TreS序列与实验室利用BLASTP建立的数据库中的序列进行比对，最终从各种嗜热细菌中筛选出5种不同的嗜热TreS同源序列。作者使用UniProt分析了结果(https://www.uniprot.org)，并鉴定了16个非保守氨基酸位点，包括Tyr21、His25、Phe28、Leu32、Gly78、Leu101、Asp115、Thr162、Phe182、Ala224、Ala265、Val289、Gly322、Ile323、Lys355和Cys506。突变位点与活性位点之间的距离在提高酶的热稳定性方面起着关键作用。据报道，当距离小于10Å时，突变将导致酶活性的大幅波动。然而，在大多数情况下，当距离超过20Å时，未发现明显的耐热突变体。作者发现4个氨基酸残基（即Gly78、Val289、Gly322和Ile323）与活性位点之间的距离为9-12Å。值得注意的是，I323L突变体的催化活性显著提高，为了解释该现象，使用SWISS-MODEL对其进行了建模(https://swissmodel.expasy.org)，以5H2T（PDB ID）为模板。使用PyMol绘制野生型TreS和I323L的3D结构，并测量底物通道。野生型TreS的通道直径为7.3Å，突变体为8.5Å。然而，底物麦芽糖的直径为8.3Å，当底物进入催化中心时，在I323L突变后面临较小的空间位阻，这可能是酶活性显著提高的一个重要原因。与Gly78对应的嗜热TreS同源蛋白序列中的氨基酸为天冬氨酸，与Val289和Ile323对应的氨基酸为亮氨酸，与GLY322对应的氨基酸为丙氨酸。因此，选择G78D、V289L、G322A和I323L四种突变体进一步评估其热稳定性。

之后对野生型TreS及其突变体进行镍柱纯化，SDS-PAGE结果表明突变不会影响酶的分子量，与野生型的分子量相同，约69kDa。相比之下，SpyTag-TreS-SpyCatcher、SpyTag-TreS-KTag和SnoopTag-TreS-SnoopCatcher、SnoopTagJR-TreS-DogTag的分子量分别为~89、~76、~87和~78 kDa。

半衰期（t1/2）是指酶活性降低50%所需的时间，是研究酶动力学稳定性的重要指标。野生型TreS在55°C下的t1/2仅为12.1分钟，而环化TreS的t1/2比线性TreS高2到3倍。T50是酶活性降低50%的温度，是研究酶热稳定性的另一个重要指标。野生型TreS的T50为53.1℃，而环化TreS的T50值分别提高了7.5-15.5°C。与环化相比，G78D、V289L、G322A和I323L的t1/2值相对较低，分别为16.2、15.0、14.4和15.2分钟，T50值分别为55.2、56.1、58.5和57.0℃。在pH值为7.2–7.4和40°C条件下，以麦芽糖为底物测量TreS突变体的动力学参数。环化TreS与天然线性TreS的Km值和Vmax值相似，表明催化效率不受环化影响。相比之下，G78D、V289L、G322A和I323L突变体的Km值不同程度增大，然而，突变体的Vmax值比野生型TreS高出2倍以上，表明突变体的酶活得到了提高。定点突变体和环化TreS的t1/2值和T50值的差异对应的p值小于0.01，表明突变和环化后热稳定性显著改善。基于这些数据，定点突变可以在一定程度上改善TreS的热稳定性。然而，与四个环化TreS突变体相比，定点突变的改善效果稍差。主要原因可能是氨基酸在正确空间位置的定点突变机制可以局部增加氢键和盐桥的数量，从而在一定程度上帮助酶在高温下保持其活性。然而，在更高的温度下，肽标签比定点突变对TreS具有更好的保护作用。因此，选择环化TreS进行进一步分析。

为了获得环化TreS的结构，从PDB下载了天然TreS（PDB ID:5H2T）的晶体结构。用I-TASSER修复肽标签SpyTag/SpyCatcher（PDB ID:4MLI），并从Streptococcus pneumoniae的RrgA晶体结构（PDB ID:2WW8）中分离SnoopTag/SnoopCatcher的结构模型。SpyTag/KTag和SnoopTagJR/DogTag采用相同的方法构建。PyMol用于获得单残基突变体的结构。作者利用编写的代码，通过矩阵变换和旋转，建立了SpyTag-TreS-SpyCatcher的结构模型。同样的方法也用于获得SpyTag-TreS-KTag、SnoopTag-TreS-SnoopCatcher和SnoopTagJR-TreS-DogTag的结构模型。

为了探索导致环化TreS热稳定性增加的机制，在300和343 K的模拟温度下进行了MD模拟。在300 K的模拟系统中，野生型TreS在15 ns后达到平衡，而环化TreS在超过25 ns后达到平衡。野生型TreS、SpyTag-TreS-SpyCatcher、SnoopTag-TreS-SnoopCatcher、SpyTag-TreS-KTag和SnoopTagJR-TreS-DogTag的RMSD值分别约为0.42、0.7、0.5、0.5和0.8 nm。当模拟系统的温度增加到343 K时，野生型TreS的RMSD值逐渐增加，表明其结构变得不稳定。相比之下，SpyTag-TreS-SpyCatcher、SnoopTag-TreS-SnoopCatcher、SpyTag-TreS-KTag和SnoopTagJR-TreS-DogTag的RMSD值分别约为0.8、0.55、0.55和0.62 nm。环化TreS在模拟温度300 K和343 K下的RMSD值相似，这表明环化TreS在不同温度下是稳定的。Rg值分析结果则表明野生型TreS的三级结构在高温下已被破坏，而环化TreS保持稳定，其结构变得紧凑，允许它们保持一定的活性水平。平衡的肽标签和TreS将产生相对较强的相互作用力，这可以在高温下保持TreS的三级结构，并防止疏水中心暴露在溶液中。

整理:王倩

　　文章信息:

　　PMID: 33285196

　　DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.11.195文章链接:

　　https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813020351333?via%3Dihub